Agora Ezio deve partir para a maior cidade da Itália, Roma, centro do poder, ganância e corrupção, para atacar o núcleo do inimigo. Para derrotar os tiranos corruptos será necessário não apenas força, mas liderança, com Ezio comandando toda a irmandade de assassinos. Só o trabalho em conjunto poderá derrotar seus inimigos mortais.
O jogo introduz um modo multiplayer inédito, que permite escolher entre uma gama de personagens Assassins, cada um com suas próprias armas e técnicas originais de assassinato, e combinar suas habilidades contra outros assassinos ao redor do mundo em diferentes modos.